استخلاص وتشخيص وتوصيف صبغتي البيتا كاروتين والبايوسيانين من بعض الأحياء المجهرية المعزولة من الأغذية ودراسة خصائصها التثبيطية

المستخلص Abstract

هدفت الدراسة الحالية الى استخلاص وتشخيص وتوصيف صبغتي البيتا كاروتين والبايوسيانين من بعض الأحياء المجهرية والمعزولة من المواد الغذائية ودراسة خصائصها التثبيطية .

استعملت في هذه الدراسة 21 عزلة مختلفة ( خمائر وبكتريا) ملونة تراوحت ألونها من البرتقالي والأصفر للخمائر ، والأخضر المزرق للبكتريا ، وزعت على قسمين ، القسم الأول هو الخمائر إذ أن عدد العزلات المنتجة للصبغة هي 9 عزلات تم الحصول على أربعة منها من الحليب الرائب وثلاثة عزلات من عصير العنب أما العزلتين المتبقية تم عزلها من العنب التالف، والقسم الثاني هو البكتريا إذ بلغت عدد العزلات 12 عزلة تم الحصول على خمسة منها من الحليب الراتب وخمسة من الجبن الطري المحلي أما المخللات فقد تم الحصول منها على عزلتين .

أجريت الغربلة للعزلات جميعها لاختيار العزلة الأكفأ انتاجا للصبغة وإجراء التجارب عليها وتحديد نوع الصبغة فيها وتحسين انتاجها وقد أوضحت النتائج ما يأتي :-

أظهرت نتائج الغربلة للخمائر الملونة أن الجنس Rhodotrula glutinis M3 هو الأكفأ إنتاجا للصبغة من بين باقي الخمائر المعزولة إذ سجل تركيزا للصبغة بلغ 22373.5 مايكروغرام لتر بامتصاصية 1.014 نانوميتر على طول موجي قدره 450 نانوميتر على أساس وزن الكتلة الجافة البالغ مقداره 13.4 غم / لتر
أظهرت نتائج الغربلة للبكتريا الملونة أن الجنس Pseudomonas aeruginosa K3 هو الأكفأ إنتاجا للصبغة من بين باقي البكتريا المعزولة إذ سجل أعلى شدة تركيز للصبغة بلغ مقداره 5.25 مايكروغرام / لتر بعد 72 ساعة على اساس وزن الكتلة الجافة المقدرة بـ 52 غم التر.
أظهرت نتائج التحليل بـ HPLC لتحديد نوع الصبغات، أن الصبغة المنتجة من الخميرة glutinis M3 . هي بيتا كاروتين إذ أظهر المرتسم البياني أن زمن احتجاز للبيتا – كاروتين القياسي الظاهر في الدقيقة 4.81 هو نفسه البيتا كاروتين الظاهر في الدقيقة 4.83 للصبغة المنتجة من الخميرة المنتخبة ، كذلك بالنسبة للصبغة المنتجة من بكتريا aeruginosa K3 هي صبغة البايوسيانين بعدما طابقت البايوسيانين القياسي والذي كان ظهور زمن احتجازه في الدقيقة 14.3 .
بينت النتائج أن أفضل طريقة لإستخلاص الصبغة من الخميرة المنتخبة هي طريقة الإستخلاص البارد باستعمال مزيج من المذيبات (الهكسان : الأسيتون ) ولمدة 4 ساعات إذ أعطت استخلاصا للصبغة من الخميرة المنتخبة مقداره 42100 مايكروغرام لتر، أما البكتريا المنتخبة فالطريقة الأمثل لإستخلاص صبغتها هي بإستعمال طبقة الكلوروفورم والنيتروجين و HCI إذ بلغت كمية الصبغة المنتجة منها 2.560 مايكروغرام مل.
أوضحت نتائج التطفير الفيزيائي لخميرة glutinis M3 . باستعمال الأشعة فوق البنفسجية ولثلاث مدد (3، 5، 7) دقائق، إذ أعطت المطفرة رقم 2 أعلى حاصل للإنتاج من الكاروتينويدات قدر بـ 42286 مايكروغرام / لتر ولمدة تعريض للأشعة فوق البنفسجية قدره 5 دقائق، بينما في بكتريا P. aeruginosa K3. كانت المطفرة رقم 5 متفوقة بالإنتاج إذ كمية الإنتاج 3.976 مايكروغرام مل عند وقت التعريض لمدة 3 دقائق .
أوضحت نتائج التطغير الكيميائي الخميرة glutinis M3 باستعمال مادة Acridine orange وللتراكيز (6، 12، 18، 24، 30، 36) مايكرو غرام مل، إذ أعطى التركيز 36 مايكروغرام مل أعلى حاصل للإنتاج من الكاروتينويدات قدر بـ 51432 مايكروغرام لتر، بينما في بكتريا P.aeruginosa K3 عند استعمال مادة Crystal Violet ولنفس التراكيز السابقة إذ أعطى التركيز 36 مايكروغرام مل أعلى حاصلا للإنتاج من البايوسيانين قدر بـ 5.523 مايكروغرام مل.
تم تحديد الظروف المثلى لإنتاج الصبغات من الجنسين المنتخبين وكما يأتي :

A. جنس R. glutinis M3

المصدر الكاربوني : تم استعمال مصادر كاربونية متعددة شملت ( كلوكوز ، الفركتوز ( كمصادر صناعية و ( ثقل التمر، ثقل العنب ( كمصادر طبيعية ناتجة من العمليات التصنيعية للمواد الغذائية، إذ أظهرت النتائج أن أعلى إنتاجية للخميرة هي عند استعمال الكلوكوز الصناعي ويليه ثقل التمر ثم يأتي ثقل العنب وأخيرا الفركتوز بكميات بلغت ( 46030، 41280، 35310، 22178) مايكروغرام التر على التوالي .

المصدر النيتروجيني : تم استعمال (خلاصة اللحم كبريتات الأمونيوم اليوريا ) إذ أظهرت النتائج أن أعلى كمية انتاجية للصبغة كان باستعمال خلاصة اللحم وأقل انتاجية كان عند استعمال اليوريا .

درجة الحررة : تم استعمال درجات حرارية مختلفة تمثلت بـ (20، 25، 30، 35، 40)، أظهرت النتائج أن الدرجة الحرارية المثلى للانتاج كان عند درجة 30 م إذ بلغت كمية الانتاج للصبغة 46140 مايكرو غرام التر .

مدة الحضن : تم استعمال مدد للحضن تمثلت بـ (24) 48، 72 96، 120 (144) ساعة، أظهرت النتائج أن المدة 96 ساعة أي في اليوم الرابع من مدة الحضن أعطت الخميرة أعلى إنتاج من الكاروتينات بلغ 46989 مايكروغرام /لتر .

التهوية : أستعملت عدة دورات للتهوية متمثلة بـ (100)، 150، 200، 250 (300) دورة دقيقة، إذ أظهرت النتائج ارتفاع كمية الكاروتينات المنتجة من الخميرة مع ارتفاع معدل التهوية وصولا الى 150 دورة / دقيقة، إذ بلغت 47012 مايكروغرام / لتر.

الرقم الهيدروجيني pH : استعملت أرقام هيدروجينية عديدة تمثلت بـ (4، 5، 6) 7 8 9)، إذ أظهرت النتائج أن أفضل رقم هيدروجيني للانتاج الصبغة من الخميرة هو 6 ، إذ بلغت كمية الكاروتينات المنتجة 48900 مايكروغرام / لتر.

حجم اللقاح : تم استعمال حجوم مختلفة من اللقاح الحاوي على الخميرة وبنسب مختلفة هي 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (10) مل، أظهرت النتائج أن حجم اللقاح الأمثل هو 6 مل إذ تم الحصول على أعلى إنتاجية من الكاروتينات وقد بلغت الكمية المنتجة 47845 مايكروغرام / لتر.

المصدر الكاربوني : تم استعمال مصادر كاربونية متعددة شملت ( كلوكوز ، الفركتوز) كمصادر صناعية و ( ثقل التمر، ثقل العنب) كمصادر طبيعية ناتجة من العمليات التصنيعية للمواد الغذائية، إذ أظهرت النتائج أن أعلى إنتاجية للبكتريا هي عند استعمال الكلوكوز الصناعي ويليه ثقل التمر ثم يأتي ثقل العنب وأخيرا الفركتوز بكميات بلغت (5.989 4.678 (3.149 (1.899) مايكروغرام مل.

المصدر النيتروجيني : تم استعمال ) خلاصة اللحم كبريتات الأمونيوم اليوريا ) إذ أظهرت النتائج أن أعلى كمية انتاجية للصبغة كان باستعمال خلاصة اللحم وأقل انتاجية كان عند استعمال اليوريا ..

درجة الحررة : استعملت درجات حرارية مختلفة شملت 20 25 30 35 40) م، أظهرت النتائج أن الدرجة الحرارية المثلى للانتاج كان عند درجة 35 م إذ بلغت كمية الانتاج لصبغة البايوسيانين 6.874 مايكرو غرام امل .

مدة الحضن استعمال مدد مختلفة شملت (24) 48 72 96، 120 (144) ساعة، إذ أظهرت النتائج أنه عند بلوغ مدة 72 ساعة أي في اليوم الثالث من مدة الحضن أعطت البكتريا أعلى إنتاج من البايوسيانين بلغ 7.123 مايكروغرام / مل.

التهوية استعملت عدة دورات للتهوية متمثلة بـ (100، 150، 200، 250 (300) دورة دقيقة، أظهرت النتائج ارتفاع كمية البايوسيانين المنتج من البكتريا مع ارتفاع معدل التهوية وصولا الى 150 دورة / دقيقة، إذ بلغت 6.732 مايكروغرام مل .

الرقم الهيدروجيني pH : استعملت أرقام هيدروجينية عديدة تمثلت بـ ( 1، 2، 3 4 5 6 7 8 9 10) أوضحت النتائج أن أفضل رقم هيدروجيني لانتاج الصبغة من البكتريا المنتخبة هو 7 ، إذ بلغت كمية البايوسيانين المنتج 6.745 مايكروغرام / مل .

حجم اللقاح : تم استعمال حجوم مختلفة من اللقاح الحاوي على الخميرة وبنسب مختلفة هي 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (10) مل، أظهرت النتائج أن حجم اللقاح الأمثل هو 6 مل إذ تم الحصول على أعلى إنتاجية من البايوسيانين بلغت 6.788 مايكروغرام مل .

B.جنس P. aeruginosa K

أظهرت نتائج التثبيط للمعاملة 2 العينة المضاف لها مستخلص البيتا كاروتين المنتج بنسبة (2%) أعلى تثبيطاً كان بواقع 17 ملم لبكتريا Staphylococcus aureus، و 15 وأقل Enterococcus faecalis و 12 ملم البكتيريا Escherichia coli ملم لبكتريا إذ بلغ Bacillus cereus Salmonella typhimurium تثبيطيا كان أتجاه بكتريا بواقع 5 و 2 ملم على التوالي.

و أعطت نتائج تثبيط المعاملة الثانية T2 ( العينة المضاف لها مستخلص البايوسين المنتج بنسبة (2%) أعلى تثبيطاً كان بواقع 28 و 25 و 20 ملم لبكتريا Escherichia coli وعلى التوالي وأقل تثبيطيا كان Bacillus cereus و Staphylococcus aureus إذ بلغ Salmonella typhimurium Enterococcus faecalis اتجاه بكتريا بواقع 9 و 5 ملم على التوالي.

المقدمة. . .Introduction

تحتل الألوان موقعاً بالغا الأهمية في مجال غذاء الإنسان، فقد اهتم البشر بالأغذية من جهة القيمة الغذائية، وأدركوا منذ عصور مبكرة أهمية الألوان في مختلف أنواع الغذاء، فقد استخدمت الألوان في صناعة الأغذية عند قدماء المصريين والبابليين والرومان والصينيين وغيرها من الحضارات القديمة، ولاسيما وأن الألوان تكسب الطعام شكلاً جميلاً وجذاباً يبهج النفس ويثيرFernandez and Morris, 2007; Bar-Yosef et. al, 2009 رغبتها وشهيتها لتناوله استعملت قديماً الخلاصات الطبيعية للمواد الملونة والمستمدة من مصادرها الطبيعية الشائعة سواء المصادر النباتية أم المصادر الحيوانية، ومع التطور الصناعي الذي شهده العصر الحديث وبالتحديد في النصف الثاني من القرن التاسع عشر بدأ استخدام المواد الملونة الصناعية في الأغذية، عن طريق استخلاص الألوان غير الطبيعية من التقطير للمستخلصات النباتية عن طريق عدد من التفاعلات الكيميائية ، وذلك لقيمتها النسبية وسهولة الحصول عليها من جوانب مختلفة، وقد أدت الطفرة الصناعية الى شيوع استخدام الملونات الصناعية فضلا عن الملونات الطبيعية، زد على ذلك سيادة الثقافة الاستهلاكية في المجتمعات المتقدمة، والتي ساهمت الى حد كبير في تعزيز استعمالات هذه المواد المصنعة في معظم العمليات الصناعية للغذائية (Meerwein et al., 2007; FAO, 2014)

تؤكد الدراسات على أن الألوان أصبحت من أهم وأشهر الإضافات التي استخدمت في كثير من الأغذية إذ إن المواد الملونة المضافة للطعام تعرف بأنها المواد التي تضاف إلى الأغذية بغرض تحسين اللون أو المذاق أو الحفظ ويرجع سبب إضافة الملونات إلى فقدان اللون الطبيعي للغذاء نتيجة التعرض للضوء أو الهواء أو الحرارة أو الرطوبة أو فقدانه أثناء التخزين بعيد المدى، وتشمل الملونات مركبات طبيعية أو صناعية تضاف لإعطاء الأغذية ألوانا مميزة ومن )Mayne, 1996; Griffiths, 2005: Kaur أهمها الكاروتينويدات وصبغة البايوسيانين (Yadav and Prabha, 2014: Aberoumand, 2011 et al., 2009;

تعد الكاروتينويدات أكبر مجاميع مركبات الملونات العضوية التي توجد بشكل طبيعي في العديد من النباتات والأحياء الدقيقة وهي المسؤولة عن الألوان الصفراء والبرتقالية والحمراء للكثير من الفواكه والخضار والازهار والأعفان والبكتيريا، وقد تم التعرف على ما يزيد عن 600 مادة ملونة تتبع هذه المجموعة، تقسم الكاروتينويدات على مجموعتين اساسيتين من الملونات الأولى كاروتينات هيدروكربونية Hydrocarbon carotenes مثل بيتا كاروتين وتوريولين، أما المجموعة الثانية فتضم زانثوفيل مؤكسد Oxidized Xanthophyll و توريولار هودين torularhodin وأستاكزانتين astaxanthine عيسى وآخرون 2015 عواد (2016) . تمتلك الكاروتينويدات خصائص حيوية مهمة فضلا عن كونها ملونات طبيعية فهي تعزز جهاز المناعة وتقلل من مخاطر الإصابة بالأمراض المزمنة كالسرطان وأمراض )Astorg )1997( القلب الوعائية تزايد الاهتمام بإنتاج الملونات ذات الطبيعة الميكروبية لاستخدامها في مجالات متنوعة من التطبيقات الصناعية، ولسهولة التعامل مع الأحياء الدقيقة وسرعة نموها وتكاثرها ورخص المواد الأولية اللازمة لتنميتها وتوافرها، فضلا عن إمكانية تحسين إنتاجها من خلال التحكم في شروط النمو للوصول إلى الظروف البيئية والتغذوية المثلى للإنتاج 2000 ,Francis) ومن أهم الأحياء الدقيقة . ) Libkind and Brook, 2006; Venil and Samy, 2009 )Vijayalakshmi et al., 2001) Rhodotorula species المنتجة للكاروتينويدات خمائر تختلف أنواع الكاروتينويدات المنتجة من الخمائر باختلاف النوع و السلالة وتركيب وسط النمو والظروف البيئية المحيطة، (1992 ,.Longo et al) تنتج خمائر Rhodotorula بشكل Simova et al., 2004( أساس كلا من بيتا كاروتين وتوريولين وتوريولار هودين وبنسب مختلفة تتباين من سلالة لأخرى ضمن النوع الواحد 2004 ,.Davoli et al) تنتشر هذه الخمائر الملونة انتشارا واسعا في الطبيعة، حيث توجد في التربة والهواء وأوراق النباتات وعلى سطح ثمار الفاكهة والعصائر الطبيعية والمربيات والحليب والاجبان (Maldonade et al., 2006)

يعد البايوسيانين مركب غير متجانس يحتوي على النيتروجين وهو أحد المركبات النتجة بالأيض الثانوي نشط الأكسدة والإختزال وقابل للذوبان في الكلوروفورم يستعمل في العديد من التطبيقات المختلفة له خاصية تثبيطية ضد العديد من المستعمرات البكتيرية ونمو الفطريات في كل من الجسم الحي والمختبر 2015 .Barakat et al. أكدت الأبحاث أن البايوسيانين مركب ذو تكلفة عالية ويحاول الباحثون العمل على جعل انتاج صبغة البايوسيانين من بكتريا Pseudomonas aeruginosa نشاطا وظيفيا ضد الميكروبات الممرضة وتمت مقارنتها Jayaseelan et al., 2014 ببعض المضادات الحيوية المستعملة في التطبيقات العلاجية (Fouly et al., 2015

ونظرا للاستخدام الواسع للملونات الصناعية في الأغذية ولا سيما أغذية الأطفال والتأثير السلبي على الصحة لاستهلاك تلك الملونات وأن للملونات المنتجة من الأحياء المجهرية لها خصائص تثبيطية على الممرضات هدف البحث إلى إنتاج الصبغات من هذه الأحياء ، وأجريت الدراسة الحالية لتشمل المحاور الآتية :-

1. عزل وتشخيص بعضا من الأحياء المجهرية المنتجة للصبغات وتشخيصها المعرفة الصفات المظهرية والإنتاجية لها .

2. تشخيص وتقدير كمية الملونات المنتجة من هذه الأحياء الدقيقة لمعرفة أنواعها .

3. تطفير الأحياء المجهرية المنتخبة للإنتاج فيزيائيا وكيميائيا للوصول الى أعلى كمية للإنتاج الملونات .

4. استعمال مصادر طبيعية متمثلة بمخلفات صناعية وظروف بيئية لتنمية الخلايا وتحفيزها على Over-production.

5. اختبار الفعالية التثبيطية للصبغات المنتجة من الأحياء المجهرية المنتخبة ضد بعضا من الأحياء المجهرية المرضية .

م.م. مرتضى شعيت

استخلاص وتشخيص وتوصيف صبغتي البيتا كاروتين والبايوسيانين من بعض الأحياء المجهرية المعزولة من الأغذية ودراسة خصائصها التثبيطية